NMR (Resonancia Magnética Nuclear) es una técnica espectroscópica basada en la absorción y emisión resonantes de ondas de radio por núcleos atómicos situados en un campo magnético intenso. Para los péptidos, constituye el método de referencia para la elucidación estructural en solución, complementario de la espectrometría de masas (identidad/pureza) y de la cristalografía de rayos X (estructura en estado sólido).
Núcleos observados. Los núcleos activos en NMR para el análisis de péptidos son: 1H (protón, abundancia del 99.98%, sensibilidad máxima, observación directa de Hα, HN y cadenas laterales), 13C (abundancia del 1.1%, requiere enriquecimiento isotópico para péptidos >10 kDa, información sobre Cα y carbonilos), 15N (abundancia del 0.37%, requiere enriquecimiento, información sobre los NH amida de la cadena principal), 19F (sonda para péptidos fluorados), 31P (péptidos fosforilados). Los espectrómetros modernos funcionan a 400-950 MHz (campo de 9.4-22.3 T), y la resolución aumenta con el campo.
Experimentos 1D y 2D. La NMR típica de péptidos combina: 1D 1H (espectro global, 8-12 ppm amida, 7-8 ppm aromáticos, 3-5 ppm Hα, 0-3 ppm metilos), 2D COSY/TOCSY (conectividades escalares, asignación de los sistemas de espín de los aminoácidos), 2D NOESY/ROESY (conectividades dipolares a través del espacio <5 Å, restricciones para la estructura 3D), 2D HSQC/HMBC (correlaciones 1H-13C o 1H-15N a 1 enlace o a 2-3 enlaces) y, para los péptidos más grandes, experimentos 3D HNCA, HNCOCA, HNCACB, CBCACONH para la asignación secuencial.
Aplicaciones en péptidos. La NMR permite: (1) la confirmación estructural por comparación con patrones, (2) la asignación secuencial de novo, (3) la determinación de la estructura 3D en solución (restricciones NOE + ángulos diedros por acoplamiento J, software XPLOR/CYANA/CNS), (4) la caracterización de péptidos cíclicos (conformaciones de giro), (5) la dinámica y el intercambio conformacional (R1, R2, NOE heteronuclear, dispersión de relajación). Es una alternativa a la cryo-EM y a los rayos X cuando la cristalización es imposible. Véase USP <761> para las directrices farmacéuticas de NMR.
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