Síntesis peptídica
La síntesis peptídica designa el conjunto de métodos para producir un péptido de secuencia definida, con un control fino de la pureza, el rendimiento y, cuando es necesario, las modificaciones no naturales. Coexisten cuatro vías principales: la síntesis química en fase sólida (SPPS), la síntesis química en solución, la producción recombinante por expresión heteróloga y la síntesis quimioenzimática (ligación química nativa, ligación enzimática mediante sortasas o subtiligasas).
La SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida), introducida por Merrifield en 1963 (Premio Nobel 1984), se convirtió en el método de referencia para los péptidos de 5 a 50 residuos. El principio: anclaje covalente del extremo C-terminal a una resina insoluble y, después, ciclos iterativos de desprotección N-terminal, lavado, acoplamiento de un nuevo aminoácido protegido, lavado y repetición hasta construir la secuencia completa. La estrategia Fmoc/tBu domina hoy (condiciones suaves, DMF, piperidina para la desprotección); la estrategia Boc/Bzl (TFA y después HF final) sigue utilizándose en ciertos casos difíciles. La calidad final depende de la eficacia de cada acoplamiento (objetivo del 99 %+ por ciclo) y de la monitorización en tiempo real mediante pruebas colorimétricas (Kaiser, cloranilo).
La síntesis en solución es adecuada para péptidos muy cortos (2-5 residuos) o para la ligación de grandes fragmentos producidos previamente por SPPS. Ofrece un control superior de cada etapa, pero exige purificaciones intermedias costosas.
La producción recombinante (E. coli, levadura Pichia pastoris, células de mamífero) sigue siendo la vía económica para los péptidos largos (>50 residuos) y las proteínas terapéuticas. Requiere etapas de clonación, expresión, lisis celular, purificación (cromatografía de afinidad, de intercambio iónico, de filtración en gel) y validación. Las modificaciones postraduccionales (glicosilación, puentes disulfuro nativos) son más fáciles de reproducir que en la síntesis química.
La síntesis quimioenzimática combina fragmentos sintéticos y ligasas (sortasa A, butelasa, subtiligasas, tripsiligasa) para unir fragmentos portadores de modificaciones no accesibles mediante SPPS. La ligación química nativa (NCL) aprovecha una cisteína N-terminal y un tioéster C-terminal para formar un enlace amida nativo en condiciones suaves, lo que permite ensamblar proteínas sintéticas de más de 150 residuos.
Las etapas críticas comunes a todas las vías son la protección ortogonal de las funciones reactivas, la prevención de la racemización (elección de los agentes de acoplamiento, basicidad controlada), la gestión de las secuencias difíciles (agregación en lámina β, prolinas consecutivas) y la purificación final por HPLC preparativa seguida del análisis de pureza (HPLC analítica, espectrometría de masas, análisis de aminoácidos).