Peptidsynthese
Die Peptidsynthese umfasst alle Methoden zur Herstellung eines Peptids mit definierter Sequenz, mit feiner Kontrolle über Reinheit, Ausbeute und, wo nötig, nicht natürliche Modifikationen. Vier Hauptwege existieren nebeneinander: die chemische Festphasensynthese (SPPS), die chemische Lösungsphasensynthese, die rekombinante Produktion durch heterologe Expression sowie die chemoenzymatische Synthese (native chemische Ligation, enzymatische Ligation durch Sortasen oder Subtiligasen).
Die SPPS (Festphasenpeptidsynthese), 1963 von Merrifield eingeführt (Nobelpreis 1984), wurde zur Referenzmethode für Peptide mit 5 bis 50 Resten. Das Prinzip: kovalente Verankerung des C-Terminus an einem unlöslichen Harz, danach iterative Zyklen aus N-terminaler Entschützung, Waschen, Kupplung einer neuen geschützten Aminosäure, Waschen und Wiederholung, bis die vollständige Sequenz aufgebaut ist. Die Fmoc/tBu-Strategie dominiert heute (milde Bedingungen, DMF, Piperidin zur Entschützung); die Boc/Bzl-Strategie (TFA, dann abschließend HF) wird weiterhin für bestimmte schwierige Fälle eingesetzt. Die Endqualität hängt von der Effizienz jeder Kupplung ab (angestrebt werden 99 %+ pro Zyklus) sowie von der Echtzeitüberwachung durch kolorimetrische Tests (Kaiser, Chloranil).
Die Lösungsphasensynthese eignet sich für sehr kurze Peptide (2-5 Reste) oder für die Ligation großer, zuvor per SPPS hergestellter Fragmente. Sie bietet eine überlegene Kontrolle über jeden Schritt, erfordert jedoch kostspielige Zwischenreinigungen.
Die rekombinante Produktion (E. coli, Hefe Pichia pastoris, Säugetierzellen) bleibt der wirtschaftliche Weg für lange Peptide (>50 Reste) und therapeutische Proteine. Sie erfordert Klonierung, Expression, Zelllyse, Reinigung (Affinitäts-, Ionenaustausch-, Gelfiltrationschromatographie) und Validierungsschritte. Posttranslationale Modifikationen (Glykosylierung, native Disulfidbrücken) lassen sich leichter reproduzieren als in der chemischen Synthese.
Die chemoenzymatische Synthese kombiniert synthetische Fragmente und Ligasen (Sortase A, Butelase, Subtiligasen, Trypsiligase), um Fragmente mit Modifikationen zu verbinden, die über SPPS nicht zugänglich sind. Die native chemische Ligation (NCL) nutzt ein N-terminales Cystein und einen C-terminalen Thioester, um unter milden Bedingungen eine native Amidbindung zu bilden, was den Zusammenbau synthetischer Proteine mit mehr als 150 Resten ermöglicht.
Kritische Schritte, die allen Wegen gemeinsam sind, umfassen den orthogonalen Schutz reaktiver Funktionen, die Vermeidung von Racemisierung (Wahl der Kupplungsreagenzien, kontrollierte Basizität), den Umgang mit schwierigen Sequenzen (β-Faltblatt-Aggregation, aufeinanderfolgende Proline) sowie die abschließende Reinigung durch präparative HPLC, gefolgt von einer Reinheitsanalyse (analytische HPLC, Massenspektrometrie, Aminosäureanalyse).